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Técnicas modernas de identificación de dos importantes agentes causales de enfermedades en tomate

Técnicas modernas de identificación de dos importantes agentes causales de enfermedades en tomate
  • Uso del diagnóstico molecular en plantas de tomate para identificar Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis y Ralstonia solanacearum

Beatriz Riverón, Bioquímico farmacéutica

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, una bacteria actinomiceto Gram positiva aerobia no esporulada y Ralstonia solanacearum, una bacteria aerobia no esporulada Gram negativa, son agentes causales de la cancrosis negra y de la marchitez bacteriana, respectivamente; son los patógenos más devastadores en los tomates (Solanum lycopersicum familia Solanaceae) cultivados tanto en invernaderos como en campos, reduciendo el rendimiento y la calidad, causando importantes pérdidas económicas en todo el mundo.

El tomate es el segundo cultivo hortícola más importante después de la patata, con una producción estimada de 187 millones de toneladas, de las cuales más de 40 millones se cultivan en los países mediterráneos.

Estos dos patógenos transmitidos por el suelo infectan las raíces de las plantas e invaden los vasos del xilema y el sistema vascular de las partes aéreas. Durante la colonización, secretan enzimas que degradan la pared celular y destruyen las células del xilema y el parénquima para adquirir nutrientes, lo que provoca un rápido marchitamiento y la muerte de la planta.

La alta letalidad de estos patógenos y su capacidad para sobrevivir en el suelo durante largos períodos dificultan la eliminación de las infecciones consecuentes. Por estas razones, estas bacterias se consideran microorganismos de cuarentena en Europa y están catalogadas como plagas A2 por la EPPO (Organización Europea y Mediterránea de Protección de las Plantas).

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis es una bacteria transmitida por el suelo capaz de infectar epífitamente tomates que, a través de aberturas y heridas naturales o de semillas infectadas, el patógeno se multiplica en los vasos del xilema donde produce extensas estructuras similares a biopelículas, promoviendo la colonización. Una vez dentro de un huésped susceptible es una seria amenaza ya que causa la muerte prematura de las plantas y por lo tanto, perjudica la producción de tomate.

Ralstonia solanacearum se considera la bacteria vegetal más destructiva del mundo y es el segundo patógeno, después de Pseudomonas syringae patovars, listado en el mayor índice de bacterias patógenas de plantas basado en su importancia científica y económica. R. solanacearum coloniza el xilema, donde puede multiplicarse rápidamente y producir grandes cantidades de biomasa celular en los tejidos, obstruyendo los vasos, lo que provoca la interrupción del transporte de agua y causa la marchitez. Después de la muerte de la planta huésped, la bacteria se libera al medio ambiente pudiendo sobrevivir durante varios años en suelos húmedos, estanques de agua, residuos de cultivos y plantas reservorio asintomáticas.


Detección de las bacterias

Los protocolos estándar para la detección de patógenos de plantas consisten en el aislamiento y la posterior identificación de los microorganismos, lo que requiere mucho tiempo y no siempre es suficientemente específico. En ocasiones, los métodos tradicionales tienen baja reproducibilidad debido a la necesidad de identificar por rasgos fenotípicos y pueden ocurrir resultados falsos negativos.

En comparación con los métodos tradicionales, las herramientas avanzadas de diagnóstico molecular permiten una detección y cuantificación fáciles, rápidas, precisas y exactas.

En el caso de los diagnósticos por PCR (polymerase chain reaction), no se requiere un enriquecimiento preliminar del microorganismo diana mediante cultivo. Esto es una ventaja debido a los tiempos analíticos más cortos. Además, la alta sensibilidad de los diagnósticos basados en ADN permite la identificación del patógeno objetivo incluso en muestras complejas. Un diagnóstico molecular eficiente y rápido de los microorganismos infecciosos permite estrategias de manejo efectivas como la aplicación de tratamientos adecuados, la toma de medidas agronómicas correctas y la erradicación.

Científicos han propuesto varios métodos de diagnóstico molecular como estrategia alternativa a los métodos microbiológicos tradicionales para la identificación y cuantificación de estas bacterias patógenas. Por ejemplo, PCR en tiempo real multiplex basado en sondas fluorescentes para la detección y cuantificación simultáneas de C.michiganensis subsp. michiganensis, P. syringae pv, y Xanthomonas.

Recientemente, han empleado una PCR digital de gotas (ddPCR)* para la detección de una carga baja de C. michiganensis subsp. michiganensis, que facilita tanto la inspección de patógenos de cuarentena como los controles de rutina del cancro negro en el tomate. En base a ellos, desarrollaron una herramienta de detección precisa y rápida basada en PCR digital de chip (cdPCR) para identificar y cuantificar la presencia de C. michiganensis subsp. michiganensis y de R. solanacearum.

La PCR digital es una nueva e importante herramienta en los diagnósticos y laboratorios de patología vegetal. Las ventajas de su empleo son la cuantificación absoluta sin depender de una curva estándar, y una mayor precisión y exactitud, en comparación con otras herramientas moleculares.

* La técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) consiste básicamente en la amplificación “in vitro” de una región específica de ADN con el fin de aumentar el número de copias deseadas, y así producir suficiente material para diversos análisis. El “digital droplet PCR” (ddPCR) combina la tecnología de gotas, formadas a partir de una emulsión agua-aceite microfluídica conteniendo la muestra a analizar. Mediante la partición, son realizadas múltiples reacciones en las que cada división puede contener o no moléculas diana. Inicialmente, el generador de gotas automatizado divide cada muestra en 20 mil gotas uniformes distribuidas en un microchip, y a continuación, se produce la amplificación del ADN repartido en cada una de las gotas, que se comportan como reacciones de PCR individuales. Finalmente, se las analizan en un lector de gotas para determinar y cuantificar la secuencia objetivo a través de la detección por fluorescencia. El análisis estadístico de señales fluorescentes de pozos positivos y negativos permite la cuantificación absoluta, sin necesidad de hacer referencia a un control estándar. Este proceso ha sido validado para cuantificar mutaciones que causan anomalías y enfermedades humanas, virus clínicos y microorganismos patógenos.

Fuentes
Morcia, C.; Piazza, I.; Ghizzoni, R.; Terzi, V.; Carrara, I.; Bolli, G.; Chiusa, G. (2023).
Molecular Diagnostics in Tomato: Chip Digital PCR Assays Targeted to Identify
and Quantify Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis and Ralstonia
solanacearum in planta
Horticulturae, 9(5): 553.

Li, Y.; Fan, B.; Li, D.; Zhang, S.; Jian, J.; Wu, Z.; Lu, Y.; Wang, Z.; Bei, W. (2020).
Chip-based digital PCR for direct quantification dynamic bacterial load in target organs of tilapia infected with Streptococcus agalactiae, a pathogen causing
meningoencephalitis in teleosts
Aquaculture Reports, 18(100548).

Imagen
https://www.cabidigitallibrary.org/doi/10.1079/cabicompendium.45009 Acceso el 21/05/2023.

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